类泛素分子Urm1修饰相关蛋白及大肠杆菌ExoI蛋白的结构与功能研究

【摘要】泛素分子(UB)和类泛素分子(UBLs)是一些小分子量蛋白,通过共价连接到蛋白质底物上,涉及一系列重要的胞内生理进程。真核生物中的Urm1是最古老的类泛素分子,在酵母中起到很多非常重要的作用,如抗氧化能力,对环境的耐受性和繁殖出芽等等。Urm1修饰系统在胞内涉及转硫作用(tRNA修饰)和蛋白类泛素修饰两方面,被认为是进化过程中的分子化石,是连接原核的转硫系统和真核的泛素家族的进化分支点。Urml系统中的Tuml蛋白是其中的重要组分,负责绝大部分的Nfs1至Uba4的转硫作用。本研究成功建立了酵母Urm1系统相关蛋白的原核表达纯化系统,并采用气相悬滴扩散法在20℃条件下培养出Tuml蛋白晶体,收集和分析了该晶体的X-射线衍射数据,衍射分辨率为1.9A。Tum1晶体的空间群属于141晶系,其晶胞参数为a=b=120.94A,c=48.35A,α=β=γ=90°。以人类3-巯基丙酮酸硫基转移酶(PDBID:30LH)的晶体结构为模型,采用分子置换法解析出Tumml的晶体结构。酵母Tumml晶体结构总体呈椭球状,拥有11个α螺旋和7个β折叠,大体上等分成两块,分属两个RLD结构域(rhodanese-likedomain).两块之间形成一个沟型地带,活性位点Cys259残基处于沟底。通过对Tuml晶体结构的分析,发现其活性位点Cys259被过硫化修饰,且活性位点附近有未知的配体小分子存在。通过实验排除了配体小分子为羟脯氨酸的可能性。大肠杆菌外切核酸酶1(Exol)是一种只从单链DNA的3’端往5’端进行持续水解的外切脱氧核糖核酸酶。Exol参与多种染色体的损伤修复和重组过程,如DNA上脱嘌呤和脱嘧啶位点的修复,氧化伤害导致的3’端磷酸羟乙酸基的去除,甲基指向的DNA链错配修复,以及抑制移码突变等等。本研究成功克隆纯化了大肠杆菌E×ol蛋白,并采用气相悬滴扩散法和气相坐滴扩散法在20℃条件下培养出Exol和3’端磷酸化修饰的单链DNA(12A-3’PHO)共结晶,Exol和dTTP共结晶以及活性抑制态Exol等若干结晶。成功收集了活性抑制态Exol结晶的X-射线衍射数据,衍射分辨率2.5A。此Exol晶体的空间群属于P212121晶系,其晶胞参数为a=67.25A,b=126.64A,c=141.25A,α==β=γ=90°。以已有的Exol晶体结构(PDBID:1F××,2QXF,3C94,3C95,3HL8,3HP9)为模型,采用分子置换法解析出活性抑制态E×ol晶体结构,发现该晶体结构中不含Mg2+离子,每个不对称单位中含有两个Exol蛋白分子。通过体外活性实验确定Mg2+离子缺失对Exol活性的完全抑制作用,和单链DNA3’端磷酸化修饰对Exol活性的不完全抑制作用,并且发现DNA的3’端自由羟基并非Exol活性所必须。在以上实验结果的基础上,提出Exol活性抑制的位阻效应假说。本论文主要对Tum1和Exol的晶体结构和生物学功能进行了研究。通过晶体X衍射法,我们首次得到并解析了Tum1和活性抑制态Exol的晶体结构。通过晶体结构分析和体外实验结合的方法,揭示它们可能的作用机制。
【作者】邱瑞；
【导师】谢毅；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2011，博士
【关键词】类泛素；Urm1；Tum1；核酸酶；Exol；晶体结构；酶学活性；

【参考文献】
[1]艾亦旻.乳酸浸泡及微波干燥对方便米粉品质的影响[D].南昌大学,农产品加工及贮藏工程,2014,硕士.
[2]何晴晴.功能力量训练对预防健美操运动损伤作用的实验研究[D].华中师范大学,体育教学,2014,硕士.
[3]陈丰,李雄耀,王世杰.矿物晶体的缺陷[J].矿物岩石地球化学通报,2012,02:160-164.
[4]石华.制造业股权结构与企业非效率投资的关系研究[D].天津财经大学,会计学,2012,硕士.
[5]周梦麟.基于电信数据挖掘的研究与应用[D].浙江工业大学,2004.
[6]郑文礼.饭店企业网络嵌入性、组织学习与战略转型能力关系研究[D].湖南师范大学,旅游管理,2013,硕士.
[7]张众.基于期权定价模型的排污权价值评估研究[D].东北财经大学,财务管理,2012,硕士.
[8]侯海军.中外房地产税收制度对比研究[D].西安科技大学,企业管理,2013,硕士.
[9]陈珍.神经危重症患者高钠血症临床特点及预后的回顾性调查研究[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[10]姜文玉.韩语副词状语在汉语中的对应形式[D].吉林大学,语言学及应用语言学,2004,硕士.
[11]刘晶.弃婴的法律保护研究[D].广东外语外贸大学,法律,2013,硕士.
[12]张婧赢.农杆菌介导的BphC基因转化紫花苜蓿的研究[D].吉林大学,环境工程,2012,硕士.
[13]李三清,刘耀驰,于金刚.羟丙基-β-环糊精-多壁碳纳米管复合材料与扁桃酸的吸附作用[J].科技导报,2013,11:60-64.
[14]姜瑛楠,冯保民,张海燕,麻密.大蒜植物络合素合酶基因转化对酵母重金属抗性的提高(英文)[J].植物生态学报,2005,04:659-664.
[15]张能.NdFeB合金表面Ni-P镀层和激光熔凝层工艺与耐蚀性研究[D].西北工业大学,材料学,2004,硕士.
[16]杨昌荣.基地经济与港口经济互动研究[J].港口经济.2004(04)
[17]李靖.基于ogre的3D地图编辑器的设计与实现[D].北京交通大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[18]杨炳儒,李岩,陈新中,王霞.Web结构挖掘[J].计算机工程,2003,20:28-30.
[19]王令其.加强队伍建设坚持教学改革办出专业特色[J].机械职业教育.2003(01)
[20]赵丹婷.会话中的修正现象探究[D].大连海事大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[21]王琦.Ne原子共面双对称条件下（e,2e）反应的理论分析和后碰撞相互作用的影响[D].安徽大学,原子与分子物理,2014,硕士.
[22]周松涛.矿用电动轮自卸车全液压转向系统设计及仿真分析[D].华南理工大学,车辆工程,2012,硕士.
[23]韩丽萍.滨州市辖区全民体育健身现状与对策研究[D].山东师范大学,体育教育训练学,2003,硕士.
[24]芦小雨.全PLC控制系统在天钢高炉中的应用[J].冶金自动化,2004,02:67-69.
[25]孙洁.城市历史性住区空间异化现象研究[D].华中科技大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[26]黄权.招生考试数据分析系统的设计与实现[D].中国人民解放军国防科学技术大学,2002.
[27]王艳娟.独立学院辅导员素质培养研究[D].西南大学,思想政治教育,2014,硕士.
[28]李峰,肖传云,阚二军,陆瑞锋,邓开明.钯和铂金属在石墨烯表面不同生长机理第一性原理研究[J].物理学报,2014,17:232-237.
[29]邵蕾.“回味法”在生活化作文教学中的研究及应用[D].首都师范大学,学科教学,2013,硕士.
[30]陆寅.500W光伏独立/并网双模逆变器的研究[D].安徽大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[31]张则青.海洋平台组块结构建造工艺研究[D].天津大学,船舶与海洋工程,2013,硕士.
[32]余鹏钧.南方某市供水管网健康评价指标体系及模型构建研究[D].广东工业大学,市政工程,2013,硕士.
[33]高素文.基于亚像素精度的立体图像匹配算法研究[D].广东工业大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[34]黄健,冯瑞华,姜山,王桂芳.国外材料计算与模拟研究进展分析[J].新材料产业,2013,10:48-51.
[35]孔叶琳.安全生产地方性立法问题研究[D].中国矿业大学,经济法学,2014,硕士.
[36]陈扬.知识管理在我国公共图书馆的实施策略[D].天津师范大学,2004.
[37]王敏.从批评性话语分析角度看中外求职类节目中的冲突话语[D].山西师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[38]王爽.氧化石墨烯在聚苯乙烯中的分散及其复合材料的发泡行为研究[D].浙江大学,2014.
[39]周道锋.基于冷却液温度的发动机热平衡试验研究[D].吉林大学,动力机械及工程,2013,硕士.
[40]张庆青.Cathepsin L通过调控EMT影响肿瘤细胞的侵袭迁移能力[D].苏州大学,药理学,2013,硕士.
[41]曹有为.生物质裂解制油热载体高速高效加热装置设计及理论研究[D].东北林业大学,机械设计及理论,2014,博士.
[42]余金山.赛事分析与预测的KDD建模[J].计算机应用与软件,2005,08:15-16+121.
[43]张有为.原子层沉积工艺在石墨烯上沉积高K栅介质研究[D].温州大学,2012.
[44]周凌燕.高中“电阻测量”实验教学的初步研究[D].苏州大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[45]樊哲翾.在不同密度条件下单混种作物的生长代谢研究[D].兰州大学,生态学,2013,硕士.
[46]倪慧.基于iOS的新闻与便民服务应用系统设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[47]朱俐蓉.中美历史课程标准比较研究[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[48]王亚芹.不明原因不孕妇女种植窗期PAF、PAF-AH水平及PAF-R的表达和意义[D].遵义医学院,妇产科学（专业学位）,2012,硕士.
[49]马丽.《演繁露》介词研究[D].青岛大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[50]方晶.中国邮政企业信息化策略与实施方案研究[D].武汉理工大学,2002.